ถึงแม้ gradient plate technique ด้วยอาหา BHI และ MICs ด้วยอาหาร BHI broth ไม่ สามารถแสดงให้เห็นถึงความไวของ lpd mutant แต่ lpd mutant แสดงความไวที่ลดลงต่อ 0.7 µg/ml oxacillin กว่า สายพันธุ์พอ่ แม่ SH1000 ด้วย MICs ในอาหาร MHM plus cation ส่ วน lpd complemented mutant แสดงการเติบโตน้อยกว่าบน gradient plate แต่ค่า MICs from MHM plus cation ไม่แตกต่างจาก lpd mutant Romero ∆crtM mutant แสดงจาก consensus ว่ามีการเติบโตสู งกว่าหรื อลดความไวต่อ 0.7 µg/ml oxacillin ต่อสายพันธุ์พอ่ แม่ Romero และ Romero pDCerm ∆crtM complemented mutant มีการเติบโตน้อยกว่า ∆crtM mutant แต่เติบโตมากกว่า สายพันธุ์พอ่ แม่หรื อเพิ่มความไว ต่อ oxacillin กว่า ∆crtM mutant และเกือบเท่ากับสายพันธุ์พอ่ แม่ MICs จาก Mueller-Hilton medium plus cation MICs สําหรับสายพันธุ์พอ่ แม่ Romero คือ 0.75µg/ml MICs for สายพันธุ์กลาย Romero ∆crtM mutant คือ 1.5 µg/ml MICs สําหรับ Romero pDCerm ∆crtM complemented mutant คือ 1.5 µg/ml MICs from the BHI broth MICs สําหรับสายพันธุ์พอ่ แม่ Romero คือ 1.5µg/ml MICs for สายพันธุ์กลาย Romero ∆crtM mutant คือ 2 µg/ml MICs สําหรับ Romero pDCerm ∆crtM complemented mutant คือ 1.5 µg/ml ทั้ง gradient plates และ MICs บน MHM plus cation and BHI media แสดงว่า Romero ∆crtM mutant ลดความไวต่อ 0.7 µg/ml oxacillin ส่ วน ∆crtM complemented mutant แสดง การเติบโตที่นอ้ ยกว่าบน gradient plate และ MICs จาก BHI เท่ากับ parent strain แต่ MICs from MHM plus cation ไม่ต่างจาก ∆crtM mutant ความไวของ S. aureus ทั้ง 6 สายพันธุ์ต่อสารต้ านจุลชี พ Crystal violet ทีเ่ ป็ น hydrophobic antimicrobial ทีค่ วามเข้ มข้ น 1 µg/ml สายพันธุ์กลาย lpd mutant จากการ consensus แสดงว่ามีการเติบโตสู งหรื อลดความไวต่อ 1 µg/ml crystal violet กว่าสายพันธุ์พอ่ แม่ SH1000 และ lpd complemented mutant และ lpd complemented mutant แสดงให้เห็นการเติบโตที่แปรผันเมื่อเปรี ยบเทียบกับทั้งสายพันธุ์พอ่ แม่และ สายพันธุ์กลาย lpd mutant MICs จาก Mueller-Hilton medium plus cation MICs สําหรับสายพันธุ์พอ่ แม่ SH1000 คือ 0.375µg/ml MICs for สายพันธุ์กลาย lpd mutant คือ 0.5 µg/ml MICs สําหรับ lpd complemented mutant คือ 0.5 µg/ml MICs from the BHI broth 20
บทที่ 4
ผลการวิจัย ในการศึกษาความไวของ Staphylococcus aureus 6 สายพันธุ์ต่อสารต้านจุลชีพ oxacillin crystal violet tetracyclineและcephalothin ทําการศึกษาโดยใช้อาหาร 3 ชนิดคือ Mueller-Hinton medium Mueller-Hinton plus Ca2+ และ Mg2+ medium และ BHI medium วิเคราะห์ความไวต่อสาร ต้านจุลชีพ ด้วย 3 กระบวนการคือ Gradient plates MICs และ Population analysis ได้ผลดังนี้ 4.1 ความไวต่ อสารต้ านจุลชีพ (Antimicrobial susceptibility) ของ S. aureus 6 สายพันธุ์ ทีว่ เิ คราะห์ โดย gradient plates ความไวต่อสารต้านจุลชีพ (Antimicrobial susceptibility) ของ S. aureus 6 สายพันธุ์ ที่ วิเคราะห์โดย gradient plates แสดงไว้ในตารางที่ 4.1 ตาราง 4.1 ความไวต่อสารต้านจุลชีพของ S. aureus 6 สายพันธุ์ วิเคราะห์โดย gradient plates สายพันธุ์แบคทีเรี ย (Bacterial strains) ความยาวเป็ นมม.เติบโตที่ 37oC (The length of growth in mm at 37oC )
Antimicrobial Strength & Hydrohobicity /media
0.7 µg/ml Oxalcillin Hydrophobic BHI MHB+cat++ MHB 1 µg/ml Crystal violet Hydrophobic BHI MHB+cat++ MHB 1 µg/ml Tetracycline Hydrophobic BHI MHB+cat++ MHB 1 µg/ml Cephalothin Hydrophilic BHI MHB+cat++ MHB
SH 1000
SH1000- bkd
SH1000 pCU-bkd
Romero
Romero ∆crtM
Romero pDCerm ∆crtM
80 38 38
80 38 38
75 34 24
73 33 41
82 36 35
78 30 35
22 8 2
20 16 30
30 6 10
30 20 20
55 10 20
35 20 20
15 5 15
13 5 25
17 7 17
- no 5 11
25 6 16
13 2 7
33 15 15
40 34 22
20 18 13
25 44 22
40 40 32
37 42 27
18
4.2 ความไวต่ อสารต้ านจุลชีพ (Antimicrobial susceptibility) ของ S. aureus 6 สายพันธุ์ ทีว่ เิ คราะห์ โดย MICs ความไวต่อสารต้านจุลชีพ (Antimicrobial susceptibility) ของ S. aureus 6 สายพันธุ์ ที่ วิเคราะห์โดย MICs แสดงไว้ในตารางที่ 4.2 ตาราง 4.2 ความไวต่อสารต้านจุลชีพของ S. aureus 6 สายพันธุ์ วิเคราะห์โดย MICs สายพันธุ์แบคทีเรี ย (Bacterial strains) MICs in µg/ml at 37oC
Antimicrobial & Hydrohobicity /media
Oxacillin Hydrophobic BHI MHB+cat++ MHB Cephalothin Hydrophilic BHI MHB+cat++ MHB Crystal violet hydrophobic BHI MHB+cat++ MHB Tetracycline hydrophobic BHI MHB+cat++ MHB
SH1000
SH1000 bkd
SH1000 pCU-bkd
Romero
Romero ∆crtM
Romero pDCerm ∆crtM
0.25
0.25 0.375 0.25
0.375 0.25
0.5,1.5 0.75 0.375
0.5,0.75,2 1.5 0.375
0.5,0.75, 1.5 1.5 1
-
-
-
0.25,0.5, 1.5 0.5
0.25,0.5, 0.75 0.5
0.5,1.5, 2 0.5
1.5,1.5 0.375 0.75
2,2 0.5 0.75
1.5,1.5 0.5 0.75
0.5,1 0.5 -
0.5,1 0.75 -
1,1 1 0.375
0.375,0.375 0.375
0.5,0.5 0.375 0.5
0.5,0.5 0.5 0.5
-
-
0.25 -
ความไวของ S. aureus ทั้ง 6 สายพันธุ์ต่อสารต้ านจุลชี พ Oxacillin ทีเ่ ป็ น hydrophobic antimicrobial ทีค่ วามเข้ มข้ น 0.7 µg/ml สายพันธุ์พอ่ แม่และ SH1000 และสายพันธุ์กลาย lpd mutant แสดงให้เห็นถึงความไวต่อ 0.7 µg/ml oxacillin เท่ากัน ส่ วน lpd complemented mutant แสดงให้เห็นถึงการเติบโตที่นอ้ ยกว่า ซึ่ งแสดงว่า lpd complemented mutant มีความไวต่อ oxacillin เพิม่ ขึ้นบน gradient plates MICs สายพันธุ์พอ่ แม่ SH1000 ด้วยอาหาร BHI และ MHB+cat++ MICs for strain lpd mutant และ lpd complemented mutant คือ 0.375 µg/ml. (MICs from Mueller-Hilton medium plus calcium and magnesium ion or cation แต่ไม่สามารถหารได้จาก BHI broth) 19
MICs สําหรับสายพันธุ์พอ่ แม่ SH1000 คือ 1.5 µg/ml MICs for สายพันธุ์กลาย lpd mutant คือ 2 µg/ml MICs สําหรับ lpd complemented mutant คือ 1.5 µg/ml ทั้ง gradient plates และ MICs บน MHM plus cation และ BHI media แสดงว่า lpd mutant ลดความไวต่อ 1 µg/ml crystal violet ส่ วน lpd complemented mutant แสดงการเติบโตที่แปร ผันบน gradient plates เปรี ยบเทียบกับทั้งสายพันธุ์พอ่ แม่และ lpd mutant แสดง MICs ที่แปรผัน ส่ วน MICs บน MHM แสดงความไวที่เท่ากันกับ lpd mutant และ MICs บน BHI แสดงให้เห็นถึง ความไวเดียวกันกับสายพันธุ์พอ่ แม่ ในสายพันธุ์แท้ Romero และสายพันธุ์กลายของมันแสดงการเติบโตที่แปรผันบน gradient plates MICs จาก Mueller-Hilton medium plus cation: MICs สําหรับสายพันธุ์พอ่ แม่ Romero คือ 0.5µg/ml MICs for สายพันธุ์กลาย Romero ∆crtM mutant คือ 0.75 µg/ml MICs สําหรับ Romero pDCerm ∆crtM complemented mutant คือ 1.0 µg/ml MICs จาก the BHI broth MICs สําหรับสายพันธุ์พอ่ แม่ Romero คือ 0.5µg/ml MICs for สายพันธุ์กลาย Romero ∆crtM mutant คือ 0.5 µg/ml MICs สําหรับ Romero pDCerm ∆crtM complemented mutant คือ 1.0 µg/ml ถึงแม้ gradient plate technique บน BHI media และ MICs บน BHI broth ไม่สามารถแสดง ให้เห็นความไวที่แตกต่างกัน สายพันธุ์กลาย ∆crtM mutant แสดงการลดความไวต่อ 1 µg/ml crystal violet กว่า สายพันธุ์พอ่ แม่ Romero โดย MICs บน MHM plus cation ส่ วนสายพันธุ์ ∆crtM complemented mutant แสดงให้เห็นถึงการเติบโตที่เกือบเท่ากันกับสายพันธุ์พอ่ แม่ และมี การเติบโตที่แปรผันเมื่อเปรี ยบเทียบกับ ∆crtM mutant บน gradient plate และแสดง showed the same MICs เท่ากันบน both media BHI และ MHM plus cation ความไวของ S. aureus ทั้ง 6 สายพันธุ์ต่อสารต้ านจุลชี พ Tetracycline ทีเ่ ป็ น hydrophobic antimicrobial ทีค่ วามเข้ มข้ น 1 µg/ml สายพันธุ์พอ่ แม่และ SH1000 และสายพันธุ์กลาย lpd mutant แสดงให้เห็นถึงการเติบโตที่ แปรผันโดย gradient plate technique MICs จาก Mueller-Hilton medium plus cation: MICs สําหรับสายพันธุ์พอ่ แม่ SH1000 ไม่สามารถวินิจฉัยได้ MICs for สายพันธุ์กลาย lpd mutant คือ 0.375 µg/ml MICs สําหรับ lpd complemented mutant คือ 0.5 µg/ml MICs จาก BHI broth 21
เฉพาะ gradient plate บน BHI media เท่านั้นที่แสดงว่า lpd mutant ลดความไวต่อ 1 µg/ml Cephalothin แต่ MICs บนอาหารทั้งสองไม่สามารถแสดงให้เห็นความแตกต่างของความ ไวต่อ 1 µg/ml Cephalothin สายพันธุ์กลาย Romero ∆crtM mutant จากconsensus แสดงการเติบโตสู งกว่าสายพันธุ์ พ่อแม่คือมีความไวที่ลดลงต่อ 1 µg/ml of กว่า Cephalothin สายพันธุ์พอ่ แม่ Romero และ Romero pDCerm ∆crtM complemented mutant จากconsensus สายพันธุ์ Romero pDCerm ∆crtM แสดงการเติบโตที่นอ้ ยกว่า สายพันธุ์กลาย ∆crtM mutant แต่เติบโตมากกว่าสายพันธุ์พอ่ แม่ MICs จาก Mueller-Hilton medium plus cation ไม่ สามารถวินิจฉัย MICs จาก Mueller-Hilton medium plus cation MICs จาก the BHI broth MICs สําหรับสายพันธุ์พอ่ แม่ Romero คือ 1.5µg/ml MICs สายพันธุ์กลาย Romero ∆crtM mutant คือ 0.75 µg/ml MICs สําหรับ Romero pDCerm ∆crtM complemented mutant คือ 1.5 µg/ml ด้วยเทคนิค gradient plate แสดงจาก consensus ว่าสายพันธุ์กลาย Romero ∆crtM mutant ลดความไวต่อ 1 µg/ml Cephalothin แต่ไม่สามารถแสดงให้เห็นความไวที่แตกต่างกัน ต่อ 1 µg/ml of Cephalothin บนอาหาร MICs และ MHM plus cation ที่น่าสนใจคือ จาก MICs บน BHI media สายพันธุ์ Romero ∆crtM mutant เพิ่มความไวต่อ 1µg/ml Cephalothin ซึ่ งเป็ น hydrophilic antimicrobial agents ตัวเดียวเท่านั้นที่ทดสอบในที่น้ ี สายพันธุ์ ∆crtM complemented mutant ซึ่ งมีการเติบโตสู งกว่าสายพันธุ์พอ่ แม่บน gradients plates มีค่า MICs เดียวกับ สายพันธุ์พอ่ แม่บน BHI 4.3 ความไวต่ อสารต้ านจุลชีพ (Antimicrobial susceptibility) ของ S. aureus ทีว่ เิ คราะห์ โดย Population analysis ความไวต่อสารต้านจุลชีพ (Antimicrobial susceptibility) ของ S. aureus ที่วเิ คราะห์โดย Population analysis แสดงไว้ในตารางที่ 4.3-4.5 และ แสดง EOP ในภาพที่ 4.1-4.2
23
ตาราง 4.3 Microdilution Plating ที่ความเข้มข้น 0-4 µg/ml Tetracycline Strains SH1000 EOP SH1000bkd EOP SH1000pCU EOP Romero EOP R. ∆crtM EOP R. PD EOP - = no growth
CFU/ml ( x ±SD) and EOP on the concentration of Tetracycline in µg/ml 0 0.25 0.375 0.5 0.75 1 1.5 2 4 6.8 X 108 ± 0.91 100% 6.5 X 108 ±1.13 100% 6.8 X 108 ±1.17 100% 3.8 X 108 ±0.45 100% 1.9 X 108 ±0.78 100% 3.5 X 108 ±0.48 100%
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
24
ตาราง 4.4 Microdilution Plating ที่ความเข้มข้น 0-4 µg/ml Crystal violet Strains SH1000 EOP SH1000bkd EOP SH1000pCU EOP Romero EOP R. ∆crtM EOP R. PD EOP - = no growth
CFU/ml ( x ±SD) and EOP on the concentration of Crystal violet in µg/ml 0 0.25 0.375 0.5 0.75 1 1.5 2 7.5X108 7.8X108 7.6X108 8.4X108 5.2X108 3.3X108 ±1.82 ±0.59 ±0.61 ±0.86 ±0.86 ±0.41 100% 104% 101% 112% 69.3% 44% 8 8 8 8 6.1X10 7.4X10 6.9X10 5.8X10 5.5X108 4.3X108 1.7X108 ±1.35 ±0.9 ±0.2 ±1.23 ±1.46 ±0.58 ±0.53 100% 102% 113% 95% 90% 70.2% 27.8% 5.7X108 5.1X108 6.5X108 6.4X108 2.3X107 ±1.41 ±2.41 ±0.75 ±0.86 ±0.45 100% 80.9% 114% 112% 4% 8 8 8 8 3.9X10 3.7X10 3.9X10 4.0X10 6.7X107 4.6X107 5.5X106 ±0.54 ±0.21 ±0.26 ±0.48 ±4.19 ±1.5 ±1.1 100% 94.8% 100% 102% 17.2% 11.61% 1.4% 8 8 8 8 3.1 X10 3.8X10 2.3X10 3.1X10 3.2X107 9.6X106 1.9X106 ±0.44 ±0.6 ±0.28 ±0.47 ±1.89 ±0.14 ±0.38 100% 122% 74.1% 100% 10.32% 3.09% 0.6% 3.7X108 3.5X108 3.8X108 4.2X108 2.3X108 1.1X108 7X107 ±0.22 ±0.36 ±0.17 ±0.55 ±0.63 ±0.27 ±2.82 100% 94.5% 102% 113% 62.1% 29.7% 18.91%
25
4 -
-
-
-
-
-
population analysis profiles ของ crystal violet EOP plots ที่เกิดขึ้นจาก microdilution plating technique (ภาพที่ 4.1) 100
ชุดข้อมูล1
10
ชุดข้อมูล2 ชุดข้อมูล3 ชุดข้อมูล4 ชุดข้อมูล5
1 0
0.25
0.5
0.75
1
1.25
1.5
1.75
2
ชุดข้อมูล6
0.1
ภาพที่ 4.1 Population analysis profiles ของ S. aureus 6 สายพันธุ์ตอ่ crystal violet ที่วเิ คราะห์จาก microdilution plate counts ชุดข้อมูล1= SH1000 ชุดข้อมูล2= SH1000 bkd ชุดข้อมูล3= SH1000pCU ชุดข้อมูล4 = Romero ชุดข้อมูล5 = Romero∆crtM ชุดข้อมูล6 = Romero pDCerm สายพันธุ์กลาย lpd mutant แสดงความไวต่อ crystal violet ที่ลดลงกว่าสายพันธุ์พอ่ แม่ SH1000 และอีก 4 สายพันธุ์ที่เหลือ สายพันธุ์ Romero และสายพันธุ์กลาย ∆crtM mutant แสดง ความไวเดียวกันต่อcrystal violet
26
ตาราง 4.5 Microdilution Plating ที่ความเข้มข้น 0-4 µg/ml Oxalcillin Strains SH1000 EOP SH1000bkd EOP SH1000pCU EOP Romero EOP R. ∆crtM EOP R. PD EOP
CFU/ml (X±SD) and EOP on the concentration of Oxalcillin in µg/ml 0 0.25 0.375 0.5 0.75 1 1.5 2 6.8 X 108 9.2 X 104 - ± 0.91 ±1.77 100% .0135% 8 5.2 X 10 6.2 X 104 5.3 X 104 4.9 X 104 - ±0.66 ±1.2 ±0.59 ±0.96 100% .0119% .01019% .00942% 5.0 X 108 - ±0.41 100% 3.6 X 108 2.9 X 104 - ±1.01 ±1.16 100% .008% 8 2.9 X 10 2.1 X 104 - ±0.69 ±0.8 100% .00724% 3.9 X 108 - ±0.64 100%
- = no growth
population analysis profiles ของ crystal violet EOP plots ที่เกิดขึ้นจาก microdilution plating technique (ภาพที่ 4.2)
27
4 -
-
-
-
-
-
100
10 ชุดข้อมูล1 ชุดข้อมูล2
1 0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.1
0.5
ชุดข้อมูล3 ชุดข้อมูล4 ชุดข้อมูล5 ชุดข้อมูล6
0.01
0.001
ภาพที่ 4.2 Population analysis profiles ของ S. aureus 6 สายพันธุ์ตอ่ oxacillin ที่วเิ คราะห์จาก microdilution plate counts ชุดข้อมูล1= SH1000 ชุดข้อมูล2= SH1000 bkd ชุดข้อมูล3= SH1000pCU ชุดข้อมูล4 = Romero ชุดข้อมูล5 = Romero∆crtM ชุดข้อมูล6 = Romero pDCerm สายพันธุ์กลาย lpd mutant แสดงความไวต่อ oxacillin ที่ลดลงกว่าสายพันธุ์พอ่ แม่ SH1000 และอีก 4 สายพันธุ์ที่เหลือซึ่ งไม่สามารถวินิจฉัยได้ 4.4 เปรียบเทียบความไวต่ อสารต้ านจุลชี พ (Antimicrobial susceptibility) ของ S. aureus 6 สายพันธุ์จากการวิเคราะห์ ท้งั 3 วิธี จากการวิเคราะห์ความไวต่อสารต้านจุลชีพของ S. aureus 6 สายพันธุ์โดยวิธี Gradient plates MICs และ Population analysis โดย Microdilution plating ได้ผลดังตาราง 4.6 และ 4.7
28
ตาราง 4.6 ผลการวิเคราะห์ความไวต่อ Oxalcillin ของ S. aureus 6 สายพันธุ์ โดยวิธี Gradient plates MICs และ Population analysis โดย Microdilution plating Strains
Gradient plates
MIC
Population analysis Microdilution plating
SH1000 same growth 0.375 SH1000bkd same growth decrease susceptibility 0.375 SH1000pCU less growth lower Romero less growth higher more growth Romero∆crtM lower Romero pDCerm less growth สายพันธุ์กลาย SH1000bkd และ Romero ∆crtM ลดความไว (decrease susceptibility) ต่อ Oxalcillin ตาราง 4.7 ผลการวิเคราะห์ความไวต่อ Crystal violet ของ S. aureus 6 สายพันธุ์ โดยวิธี Gradient plates MICs และ Population analysis โดย Microdilution plating
Strains SH1000 SH1000bkd SH1000pCU Romero Romero∆crtM Romero pDCerm
Gradient plates
MIC
Population analysis Microdilution plating
less growth more growth less growth no different no different no different
1.5
-
2
decrease susceptibility
1.5
-
0.5,0.5
-
0.5,0.75
-
1.0,1.0
-
สายพันธุ์กลาย SH1000bkd ลดความไว (decrease susceptibility) ต่อ Crystal violet ความ ไวของสายพันธุ์พอ่ แม่ Romero และสายพันธุ์กลาย Romero ∆crtM ต่อ Crystal violetไม่แตกต่าง กัน
29
