บทที่ 3
ระเบียบวิธีวจิ ัย ในการศึกษาความไวต่อสารต้านจุลชีพของ Staphylococcus aureus สายพันธุ์ต่างๆ มี ระเบียบวิธีวจิ ยั ดังนี้ 3.1 สายพันธุ์แบคทีเรี ย แบคทีเรี ยทดสอบที่ใช้ คือ Staphylococcus aureus สายพันธุ์ต่างๆ ได้แก่ S. aureus SH1000 เป็ น wild type parental strain สายพันธุ์แท้ที่เป็ นสายพันธุ์พอ่ แม่ที่ใช้ใน การสร้างสายพันธุ์กลายในชีวสังเคราะห์ BCAFs S. aureus SH1000 bkd เป็ นสายพันธุ์กลาย (Mutant) ในชีวสังเคราะห์ BCAFs โดยการ knockout lpd gene ของ branched-chain α-keto acid dehydrogenase (bkd) gene cluster ถูกสร้าง ขึ้นจาก สายพันธุ์ S. aureus parental SH1000 โดยการสอดใส่ kanamycin resistance cassette ใน บริ เวณที่เป็ นรหัสของ lpd gene ซึ่ งเป็ นรหัสสําหรับ lipoamide dehydrogenase. (Sing et al. 2008) S. aureus 1000 pCU-bkd เป็ น lpd complemented mutant S. aureus Romero เป็ น wild type parental strain ที่ใช้ในการสร้างสายพันธุ์กลาย S. aureus Romero∆crtM (Pelz,et al.2005) S. aureus Romero∆crtM เป็ นสายพันธุ์กลายที่มีการ deletion ใน crtM จึงมีความ บกพร่ องในชีวะสังเคราะห์ carotenoid จึงมีสีขาว ในชี วะสังเคราะห์ staphyloxanthin gene จัดเรี ยง กันใน crt operon (crtOPQMN) ซึ่งมี SigB-dependent promoter upstream ของ crtO (Pelz,et al.2005) S. aureus Romero pDCerm∆crtM เป็ น complemented mutant S.aureus สายพันธุ์ต่างๆ นี้ได้จากห้องปฏิบตั ิการ Microbiology Group, Department of Biological Sciences, Illinois State University, Normal, Illinois 61790-4120 3.2 อาหารทีใ่ ช้ (Media) อาหารที่ใช้ในการดําเนินการทดลองทั้งหมดนี้ใช้ Brain heart Infusion (BHI) broth และ agar Mueller-Hinton medium และ Mueller-Hinton ที่เพิ่ม Ca2+ และ Mg2+ ion 3.3 สารต้ านจุลชี พ (Antimicrobials) สารต้านจุลชีพที่ใช้ทดสอบทั้งหมดดังตาราง 3.1 14
ตาราง 3.1 สารต้านจุลชีพ (Antimicrobials) ที่ใช้ศึกษา Antimicrobial Agents Oxacillin Crystal violet Tetracycline Cephalothin N = Nikaido (Nikaido,1976)
Nikaido’s Hydrophobicity N hydrophobic N hydrophobic N hydrophobic N hydrophilic
Strength (µg/ml) 0.7 1 1 1
Partition Coefficient 0.07 14.4 0.07 < 0.01
3.4 การวินิจฉัยความไวต่ อสารต้ านจุลชี พ (Susceptibilities Determination) การวินิจฉัยความไวต่อสารต้านจุลชีพโดยวิธี Gradient plates วิเคราะห์ MICs โดยวิธี microdilution broth methods และทําการวิเคราะห์ประชากร (Population analysis) 3.4.1 Gradient plates Gradient plates ที่ใช้เป็ น plates สี่ เหลี่ยมขนาด 90 mm X 90 mm เทอาหาร BHI agar 35 ml ที่มีสารต้านจุลชีพชนิ ดที่ศึกษาลงใน plates วาง plates ให้เอียงบน ปิ เปตแก้วขนาด 1 ml เพื่อให้ เกิดความลาดเอียง gradient หลังจากอาหารแข็งตัวเท BHI agar ที่ไม่มีสารต้านจุลชีพ antimicrobial ทับชั้นบน ตั้งให้วนุ ้ แข็งตัว บ่ม plates ข้ามคืนที่ 37oC เพื่อให้สารต้านจุลชีพแพร่ ผา่ นขึ้นสู่ ช้ นั บน เพื่อให้เกิด gradient ในขณะเดียวกันเพาะเลี้ยงสายพันธุ์แบคทีเรี ยทดสอบให้เติบโต ใน BHI broth ที่ 37oC พร้อม shaking เป็ นเวลา 16 ชัว่ โมง หลังจากเพาะบ่ม ทําการเจือจาง 1:50 ใน BHI broth เพื่อให้เติบโตที่ 37oC พร้อม shaking จนกระทัง่ ได้ OD600 of 0.2-0.4. ทําการเพาะแบคทีเรี ยที่ได้บน BHI agar gradient plates โดยใช้ไม้พนั สําลีที่ผา่ นการฆ่าเชื้อแล้วขีดลากจากบริ เวณที่มีสารต้านจุล ชีพตํ่าสุ ดขึ้นมา บ่มเพลตที่ 37oC เป็ นเวลา 48 ชัว่ โมง หลังจาก 48 ชัว่ โมงประเมินความไวต่อสาร ต้านจุลชีพโดยวัดความยาวของการเติบโตของแบคทีเรี ยตาม antimicrobial gradient วิธีดาํ เนินการ เป็ นขั้นตอนดังนี้ 1. เตรี ยม BHI agar Gradient plates โดยใช้อาหาร BHI agar ที่มีสารต้านจุลชีพที่มีความ เข้มข้นเพิ่มขึ้นเรื่ อยๆ 2. เพาะเลี้ยง S. aureus สายพันธุ์ต่างๆ ให้เติบโตที่ OD600 of 0.2-0.4 3. Innoculation S. aureus สายพันธุ์ต่างๆ โดยการ Swap ลงบน BHI agar Gradient plates 4. บ่ม Plates ที่ 37oC เป็ นเวลา 48 ชัว่ โมง 5. วิเคราะห์ antimicrobial susceptibility โดยการวัดความยาวของแบคทีเรี ยที่เติบโตบน plates 15
3.4.2 Minimum Inhibition Concentration (MICs) วิเคราะห์ MICs โดยวิธี microdilution broth methods การวิเคราะห์ MICs ทําโดยใช้วธิ ี microdilution broth methods โดยใช้ microdilution trays ตามวิธีมาตรฐานของ National Committee for Clinical LaboratoryStandards (NCCLS, 2003) โดย ใช้อาหาร Mueller-Hinton medium, Mueller-Hinton plus Ca2+และ Mg2+ medium และ BHI medium (Singh et al., 2008) ทําการเจือจางเป็ นสองเท่า (Two-fold serial dilution) โดยผสมความ เข้มข้นตามลําดับของสารต้านจุลชีพที่เลือกกับแบคทีเรี ยที่เพาะเลี้ยงที่มีค่า OD600 อยูร่ ะหว่าง 0.2-0.4 เพาะบ่ม Microtiter plates ที่37 oC เป็ นเวลา 24-36 ชัว่ โมง เพื่อให้แน่ใจว่าสายพันธุ์กลายเติบโตเท่า เทียมกับสายพันธุ์พอ่ แม่ วิเคราะห์หาค่า MICs ของทั้ง 6 สายพันธุ์ต่อ oxacillin, cephalothin, crystal violet, and tetracycline วิธีดาํ เนินการเป็ นขั้นตอนดังนี้ (1) ใช้ microdilution trays ตามวิธี National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2003) บนอาหาร Mueller-Hinton medium และ Mueller-Hinton ที่เพิ่ม Ca2+และ Mg2+ และอาหาร BHI (Singh et al., 2008) (2) ทําการเจือจาง สารต้านจุลชีพทีละสองเท่าเป็ นลําดับ (Two-fold serial dilution) (3) ใส่ แบคทีเรี ยที่เพาะเลี้ยงที่ OD600 อยูร่ ะหว่าง 0.2-0.4 (4) บ่ม Microtiter plates ที่ 37 oC เป็ นเวลา 24-36 ชัว่ โมง (4) วิเคราะห์หาค่า MICs 3.4.3 วิเคราะห์ ประชากร (Population analysis) วิเคราะห์ประชากรด้วยวิธี microdilution plating ใช้อาหาร BHI agar at 37 oC ตามวิธีการ ของ Pfeltz. (Pfeltz et al., 2001) ทําการเพาะเลี้ยงแบคทีเรี ยแต่ละสายพันธุ์ 1 คืน ทําการเจือจางเป็ น ลําดับและ plate บนอาหาร BHI agar ที่มีสารต้านจุลชีพความเข้มข้นต่างๆ (0.25, 0.375, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2 and 4 µg/ml) ทํา microdilution plating โดย plating สี่ หยดของ 10 µl droplets of 101 -3 -5 -7 ,10 ,10 ,10 บนเพลตเดียวที่มีสารต้านจุลชีพความเข้มข้นที่กาํ หนด เพาะบ่ม Plates เป็ นเวลา 4896 ชัว่ โมงและนับโคโลนี นับโคโลนีใน Plated droplets ที่มีโคโลนี อยูร่ ะหว่าง 5-90 CFU โดยใช้ เครื่ องนับโคโลนีที่มีแว่นขยาย ค่า EOP ที่ได้เป็ นเปอร์ เซ็นต์ของ CFU ที่รอดชีวิต ในความเข้มข้น ของสารปฏิชีวนะที่ศึกษา เปรี ยบเทียบกับ control plates ที่ไม่มีสารปฏิชีวนะ วิธีดาํ เนินการเป็ นขั้นตอนดังนี้ (1) การเจือจาง S. aureus สายพันธุ์ต่างๆ เป็ นลําดับ และ Plate บนอาหาร BHI agar ที่มี สารต้านจุลชีพ ในความเข้มข้นที่เป็ นลําดับ (2) ทําการ microdilution plating โดยใช้ 10 µl droplets of 10-1,10-3,10-5,10-7 4 จุดใน plate เดียว 16
(3) บ่ม Plates ที่ 37 oC เป็ นเวลา 48-96 ชัว่ โมง (4) นับโคโลนี หาค่า EOP เป็ น เปอร์ เซ็นต์ ของ CFU ที่รอดชีวติ ในความเข้มข้นของสาร ต้านจุลชีพ เปรี ยบเทียบกับ Plate ที่ไม่มีสารต้านจุลชีพ
17
