บทที่ 2
ทบทวนเอกสารและงานวิจัยที่เกีย่ วข้ อง 2.1 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus เป็ นแบคทีเรี ยแกรมบวก เติบโตได้ในสภาวะที่เป็ น aerobic และ anaerobic เซลล์อยูเ่ ป็ นกลุ่มคล้ายพวงองุ่นโดยมี แหล่งที่อยูค่ ือเยื่อบุโพรงจมูก และผิวหนังของ สัตว์เลือดอุ่น เป็ นเชื้อก่อโรคที่แพร่ หลาย ทําให้เกิดการติดเชื้อในชุมชนและในโรงพยาบาล สร้าง สารพิษหลายชนิดส่ งผลให้เกิดโรคหลายชนิด ส่ งผลทําให้มีอตั ราการตายสู งในยุคก่อนสาร ปฏิชีวนะ (preantibiotic era) S. aureus เป็ นเชื้ อโรคที่แพร่ หลาย ที่ทาํ ให้เกิดการติดเชื้อในอวัยวะ และเนื้อเยื่อต่างๆ และเกิดความเป็ นพิษ ช่วงการติดเชื้อมีต้ งั แต่มีความรุ นแรงระดับอ่อน เช่น การติด เชื้อที่ผวิ หนังและอาหารเป็ นพิษ toxic-shock syndrome staphylococcal scarlet fever ไปจนถึงมี ความรุ นแรงที่ทาํ ให้เสี ยชีวติ เช่น pneumonia sepsis osteomyelitis และ infectious endocarditis นอกจาก S. aureus จะส่ งผลทําให้เกิดการติดเชื้อที่รุนแรงแล้ว S. aureus ยังต้านทานต่อสาร ปฏิชีวนะหลายชนิดในวงกว้าง สายพันธุ์ S. aureus ที่ตา้ นทานสารปฏิชีวนะหลายชนิดได้ปรากฏ ขึ้น ในปี ค.ศ. 1961 S. aureus ได้พฒั นาขึ้นต้านทานต่อ methicillin ตั้งแต่ทศวรรษ 1970s สายพันธุ์ ต้านทานเมทิซิลลิน methicillin-resistant S. aureus (MRSA) ได้กลายเป็ นสาเหตุหลักของการติดเชื้อ ใน nosocomial ทางเดินหายใจ การแพร่ ระบาดทัว่ โลก S. aureus ที่ตา้ นทานเมทิซิลินพบทั้งที่ เกี่ยวเนื่องกับโรงพยาบาล (HA-MRSA) และที่เกี่ยวเนื่องกับชุมชน (CA-MRSA) MRSA เป็ นสาเหตุ ทําให้เกิดการติดเชื้อถึงตายได้ เช่น necrotizing pneumonia แม้จะเกิดขึ้นในประเทศที่มีระบบการเฝ้า ระวังรักษาที่ดี สายพันธุ์เหล่านี้ลว้ นเป็ นอันตรายต่อสุ ขภาพของสาธารณชน MRSA ต้านทานต่อสารปฏิชีวนะ beta-lactam ทั้งหมดโดยกลไกที่ไม่เกี่ยวข้องกับการ ทําลายยาและต้านทานต่อสารปฏิชีวนะหลายตัวที่ไม่สัมพันธ์กนั ที่ตา้ นเป้ าหมายต่างๆ Klevens et al. (2007) คาดคะเนว่า ประชากร 94,360 คนมีการติดเชื้ อ MRSA ที่รุนแรงเกิดขึ้นในสหรัฐในปี ค.ศ. 2005 และ 18,650 (19.8%) คนตาย ในการสํารวจครั้งนั้น การติดเชื้อส่ วนใหญ่ สัมพันธ์กบั การ สุ ขาภิบาล (85%) 58.4% การติดเชื้อในชุมชน 26.6% ติดเชื้อในโรงพยาบาล การติดเชื้อ MRSA จึง เป็ นภัยคุกคามหลักต่อการสาธารณสุ ขในอเมริ กาและประเทศอื่นๆ Vancomycin ซึ่ งเป็ น glycopeptide antibiotic เป็ นสารปฏิชีวนะตัวเดียวเท่านั้นที่สามารถ ต่อต้านการติดเชื้ อของ S. aureus ได้และ S. aureus ทุกสายพันธุ์ยงั คงมีความไว จนกระทัง่ ในปี ค.ศ.1997 ได้มีการค้นพบสายพันธุ์ S. aureus ที่ลดความไวต่อ Vancomycin ลง สายพันธุ์ที่ตา้ นทาน vancomycin ปานกลาง vancomycin intermediate-resistant S. aureus (VISA) ได้ถูกคัดแยกออกมา
4
(Hiramatsu et al., 1997) ปั จจุบนั ได้มีการรายงานพบ VISA ทัว่ โลก (Tenover and Moellering, 2007) 2.2 สารต้ านจุลชี พ (Antimicrobials) จากการที่ S. aureus แพร่ ระบาดและก่อให้เกิดโรคต่างๆ จึงมีความต้องการสารเคมีท่ีใช้ตา้ น จุลชีพหลากหลายชนิดที่นาํ มาใช้ในสถานการณ์ต่างๆ กันทั้งในโรงพยาบาลและทางการสาธารณสุ ข สารต้านจุลชีพที่ใช้กนั อย่างกว้างขวางในการควบคุม และป้ องกันการแพร่ กระจายจากการติดเชื้ อ ได้แก่ สารระงับเชื้ อ (Antiseptics) สารทําลายเชื้อ (Disinfectants หรื อ Biocides) สารปฏิชีวนะ (Antibiotics) และเพปไทด์ตา้ นจุลชีพ (Antimicrobial peptides) สารเหล่านี้เป็ นองค์ประกอบที่ สําคัญที่ใช้กนั ในการควบคุมและป้ องกันการแพร่ กระจายของการติดเชื้อ เช่นการติดเชื้อในทางเดิน หายใจ โพรงจมูก (McDonnell and Russell,1999) สารปฏิชีวนะใช้รักษาโรคติดเชื้อภายในร่ างกาย โดยมีเป้ าหมายต่างๆ เพปไทด์ตา้ นจุลชีพเช่น platelet microbial proteins เชื่อว่าเป็ นองค์ประกอบ ของระบบภูมิคุม้ กันภายใน (Yeaman,1997) ได้มีความพยายามที่จะพัฒนาเพปไทด์ตา้ นจุลชีพเพื่อ จุดประสงค์ใช้ในการบําบัดรักษาทางเคมี (Chemotheraputics purposes) (Straus and Hancock,2006) สารต้านจุลชีพเหล่านี้เข้าโจมตีเยือ่ หุ ม้ เซลล์โดยตรงในส่ วนที่เป็ นกลไกการทํางานหรื อเข้า ทําปฏิกิริยากับองค์ประกอบของเยือ่ หุ ม้ หรื อ membrane หรื อผ่าน membrane ไปยังเป้ าหมายใน เซลล์ สารระงับเชื้อ (Antiseptics) และสารทําลายเชื้อ (Disinfectants) สารประกอบเหล่านี้มีลกั ษณะ กลัวนํ้า Hydrophobics ที่ทาํ ปฏิกิริยากับ Cytoplasmic membrane ตัวอย่างเช่น Ethyl alcohol Isopropyl alcohol n-propanol ถูกใช้เป็ นสารทําลายเชื้อที่ผวิ ของของแข็งและเป็ นสารระงับเชื้ อที่ ผิวหนัง เชื่ อว่าทําให้เยือ่ หุ ม้ Membrane ฉี กขาด และทําให้โปรตีนเสี ยสภาพ Triclocarban (3.4,4’-triclorocarbanilide)ใช้ในสบู่แลสารซักฟอก เชื่อว่าทําปฏิกิริยากับ cell membrane ทําลายลักษณะของความเป็ นเยื่อเลือกผ่าน semipermeable nature Chlorohexidine เป็ น biguanide ใช้อย่างกว้างขวางในผลิตภัณฑ์ลา้ งมือ กลั้วปาก สารนี้ทาํ ให้ cell membrane เสี ยหาย ทําให้องค์ประกอบภายในเซลล์รั่วออกมาและเชื่อว่าส่ งผลให้เซลล์ตาย Phenol ใช้เป็ นสารต้านจุลชีพ ส่ งผลต่อ membrane (Denyer, 1995) Triclosan เป็ นตัวอย่าง ของ bis-phenol ใช้กนั อย่างกว้างขวางต่อต้านแบคทีเรี ยแกรมบวก ใช้กนั อย่างกว้าวขวางในสบู่ ผลิตภัณฑ์ลา้ งมือ ยาสี ฟัน และผลิตภัณฑ์อื่นๆ ใช้เป็ นสารทําลายเชื้อ (Biocide) ที่ใช้กนั ทัว่ ๆไป มี หลักฐานที่นาํ เสนอว่า Triclosan พุง่ เป้ าไปที่ FabF ในชีวะสังเคราะห์ fatty acid (Heath et al., 1998; McMurry et al., 1998). แต่มีกิจกรรมทัว่ ไปในการต้าน Cytoplasmic membrane Hexachlorophene เป็ น membrane-active bis phenol อีกตัวหนึ่ง Quaternary ammonium compounds เป็ นสารทําลายเชื้ อที่ผวิ (surfectants) ใช้กนั อย่าง กว้างขวางในการทําความสะอาดผิวแข็ง ลักษณะของโมเลกุลเป็ น hydrophobic hydrocarbon และมี บริ เวณที่เป็ น Hydrophilic polar regions ประจุหรื อ ionization ของหมู่ hydrophilics group แตกต่าง 5
กัน Cationic quaternary ammonium compounds ถูกใช้อย่างกว้างขวางเป็ นสารระงับเชื้อและสาร ทําลายเชื้อ ซึ่ งเป็ นตัวการที่มีผลต่อ membrane (membrane-active agents) สารปฏิชีวนะ (Antibiotics) สารปฏิชีวนะจํานวนหนึ่งทําปฏิกิริยากับ membrane ตัวอย่าง vancomycin ทําปฏิกิริยากับ lipid II Fluidity ของ membrane อาจส่ งผลต่อ ปฏิกิริยาของ vancomycin กับสารตัวกลางนี้ในชีวะสังเคราะห์ Peptidoglycan สารปฏิชีวนะต่างๆ มีลกั ษณะ พื้นฐานเป็ น Hydrophobic ขึ้นอยูก่ บั การแบ่งส่ วนระหว่าง Hydrocarbon และชั้นที่เป็ นนํ้า aqueous phases (Nikaido, 1976) คาดว่า Hydrophobic agents แบ่งส่ วนใน membrane ขณะที่มนั เข้าใกล้เป้ า ภายในเซลล์ membrane fluidity อาจส่ งผลกระทบต่อความไวต่อสารเหล่านี้ ตัวอย่างสารปฏิชีวนะที่ เป็ น Hydrophilic Antibiotics ได้แก่ Benzylpenicillin Ampicillin Cephalothin Carbernicillin Neomycin และ D-cycloserine เพปไทด์ตา้ นจุลชีพ (Antimicrobial peptides) Platelet microbicidal proteins ถูกปล่อยออก จาก mammalian platelets มีบทบาทสําคัญเป็ นตัวการต่อต้านภายในเจ้าบ้าน innate host defense ต้าน endovascular infections (Bayer et al., 2006) tPMP-1 cationic antimicrobial peptide ที่ปล่อย ออกมาจาก thrombin-stimulated rabbit platelets สายพันธุ์กลายที่ตา้ น tPMP-1 แสดงให้เห็นถึงการ เพิ่มขึ้นของ membrane fluidity (Bayer et al., 2000) Daptomycin เป็ น acidic lipopeptide ที่ถูกค้นพบเพื่อใช้ในการรักษาการติดเชื้ อที่เกิดจาก แบคทีเรี ยแกรมบวก Streptomyces roseosporus (Alder, 2005) Daptomycin ที่ถูกนํามาใช้ใหม่เป็ น ตัวการ antistaphylococcal มีรูปแบบควบคู่ในการยับยั้ง ชีวะสังเคราะห์ peptidoglycan biosynthesis และเป็ นสาเหตุทาํ ให้ depolarlization ของ membrane (Muthaiyan et al., 2008; Silverman et al., 2003). Daptomycin แทรกเข้าไปใน membrane ก่อให้เกิดรู ข้ ึน ได้มีรายงานถึงการค้นพบสายพันธุ์ที่ ลดความไวต่อ Daptomycin (Friedman et al.,2006; Jones et al., 2008) สายพันธุ์ VISA บางสาย พันธุ์ลดความไวต่อ Daptomycin แต่เพิ่มความไวต่อ Vancomycin (Cui et al., 2006; Muthaiyan et al., 2008) สายพันธุ์ตา้ น Daptomycin มีการเพิ่ม membrane fluidity ซึ่ งทําให้มีการเพิ่ม cytoplasmic membrane fluidity แต่ไม่แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงองค์ประกอบของ fatty acid (Jones et al., 2008) Polar lipids ของ S. aureus รวมทั้ง phospho และ glycolipids glycolipids เหล่านี้ ประกอบด้วยสาย fatty acids สองสาย สาย fatty acyl เหล่านี้เป็ นตัวกําหนด ความหนืด (viscosity) หรื อความยืดหยุน่ (fluidity) ของ membrane Membrane fluidity ส่ งผลกระทบหลักต่อการทําหน้าที่ ต่างๆ ของ membrane รวมทั้งการยอมให้โมเลกุลที่กลัวนํ้า (hydrophobic molecules) แพร่ ผา่ น (passive permeability) active transport ของตัวถูกละลาย และปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนต่อโปรตีน (Zang and Rock, 2008) การเปลี่ยนแปลงขององค์ประกอบที่เป็ น fatty acids เกิดขึ้นเพื่อตอบสนอง ต่อสิ่ งแวดล้อมทางกายภาพและทางเคมีที่เกี่ยวข้องกับการเติบโตเพื่อรักษาสมบัติทาง biophysics 6
ของ membrane การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้เป็ นการปรับตัวทาง homeoviscous และทําหน้าที่ในการ ดัดแปลง (modify) permeability ของ membrane ลดการใช้เพลังงานและทําให้การเติบโตเหมาะสม ที่สุด (Zang and Rock,2008) fatty acids หลักของ S. aureus คือ BCFAs ได้แก่ anteiso fatty acids และ iso fatty acids ทั้งเลขคู่และเลขคี่ Iso fatty acids ลด membrane fluidity เมื่อเปรี ยบเทียบกับ anteiso fatty acids anteiso fatty acids มีจุดหลอมเหลว melting points ตํ่า อุณหภูมิในการเปลี่ยน สถานะตํ่า lower phase transition temperature และครอบครองบริ เวณภาคตัดตามขวางใหญ่กว่าทั้ง ของ SCFAs หรื อ iso fatty acids (Suutari and Laakso, 1994; Willeke and Pardee, 1971) พบ SCFAs ที่อิ่มตัว (saturated) และไม่อ่ิมตัว (unsaturated) ใน S. aureus แต่ในปริ มาณที่ต่าํ กว่า BCFAs โดยทัว่ ไปในแบคทีเรี ยแกรมลบ การลด membrane fluidity สัมพันธ์กบั การลดความไว (Susceptibility) ต่อสารประกอบ Hydrophobic ถึงแม้เยือ่ หุ ม้ ชั้นนอก (outer membrane) ของ แบคทีเรี ยแกรมลบมีบทบาทสําคัญต่อความทนต่อตัวทําละลาย การเปลี่ยนองค์ประกอบของ fatty acids ทั้งหมด สําคัญต่อความทนต่อตัวทําละลาย ใน Escherichia coli และ Pseudomonas putida การเปลี่ยนแปลง unsaturated fatty acids จาก cis ไปเป็ น trans โดยการใช้ cis-to-trans isomerase ทําให้เกิดการตอบสนองสั้นๆ ต่อ ตัวทําละลายอินทรี ยท์ ี่เป็ น hydrophobics (Heipieper et al., 1992; Junker and Ramos, 1999) การเปลี่ยนแปลงอื่นๆ ได้แก่ การเพิ่มองค์ประกอบของ saturated fatty acids และการเพิ่มอัตราส่ วนของ long chain ต่อ short chain fatty acids (Pinkart et al., 1996) การ เปลี่ยนแปลงทั้งหมดเกี่ยวข้องกับกับการลด Membrane fluidity และเชื่อว่าทําให้ cytoplasmic membrane มีเสถียรภาพ (stabilize) ในกรณี ที่มีตวั ทําละลาย Nielsen et al. (2005) พบว่า ความทนต่อ toluene และตัวทําละลายอื่นๆ ในสายพันธุ์ S. haemolyticus ที่คดั แยกจากกระเพาะตัวอ่อนแมลงวัน เพิ่มกรดไขมัน anteiso จาก 25.8% เป็ น 33.7% และลด SCFA C20:0 จาก 19.3% ไปเป็ น 10.1% การเปลี่ยนแปลงองค์ประกอบของกรด ไขมันนี้ คาดว่าเป็ นการเพิ่ม membrane fluidity องค์ประกอบของ phospholipid มีการเปลี่ยนแปลง เล็กน้อยเมื่อได้รับตัวทําละลาย พบว่า S. aureus สายพันธุ์ Staphylococcus epidermidis มีความ ต้านทานต่อตัวทําละลาย สายพันธุ์ของ S. aureus แสดงให้เห็นถึงการต้านทานต่อ platelet microbicidal protein tPMP-1 ที่เกิดขึ้นเนื่องจาก transposon mutagenesis serial passage ในกรณี มี tPMP-1 หรื อ การมี multiresistance plasmid ทั้งหมดแสดงถึง การเพิ่ม membrane fluidity เมื่อเปรี ยบเทียบกับสายพันธุ์ ร่ วมกันที่มีความไว (Bayer et al., 2000) สามารถวัด Fluidity บนพื้นฐานขององค์ประกอบของกรด ไขมันโดยตรงโดยใช้ fluorescence spectrometry โดยใช้ 1,6-diphenyl-1, 3,5-hexatriane (DPH) เป็ น membrane probe
7
สายพันธุ์ที่ตา้ นทาน daptomycin ที่คดั แยกทางคลินิกที่เกิดขึ้นในระหว่างการบําบัดรักษา คนไข้โรคหัวใจ Endocarditis ด้วย daptomycin แสดงให้เห็นถึงการเพิ่ม membrane fluidity (Jones et al., 2008) สายพันธุ์ตา้ น Daptomycin (Daptomycin-resistant mutants) มี membrane fluidity เพิม่ ขึ้น (Jones et al., 2008) สายพันธุ์ที่ไม่ไวต่อ daptomycin มีดชั นี fluorescence polarization ที่ 0.33 ± 0.001 เมื่อเปรี ยบเทียบกับสายพันธุ์พอ่ แม่ 0.36 ± 0.001 ทั้งสองสายพันธุ์ไม่มีความแตกต่าง ในเรื่ อง fatty acid parameters เช่น profiles ความยาวของ acyl สัดส่ วนของ BCFAs หรื ออัตราส่ วน iso : anteso ในกรณี ของความทนต่อตัวทําละลาย และการลดความไวต่อ antimicrobial peptide มี ความสัมพันธ์ระหว่างลักษณะเหล่านี้กบั การเพิม่ membrane fluidity ใน staphylococci BCFAs ได้ จากชีวะสังเคราะห์ใน pathway ที่เกี่ยวข้องกับ branched-chain α-keto acid dehydrogenase ซึ่ งเป็ น องค์ประกอบของเอนไซม์เชิ งซ้อนถูกถอดรหัส (encoded) จาก bkd gene cluster ได้มีการ สร้างสายพันธุ์กลายใน lpd gene ของ bkd operon ที่ขาด BCFAs (Singh et al., 2008) สายพันธุ์ กลายโตช้ากว่าสายพันธุ์พอ่ แม่ ที่ 20oC และไม่โตที่ 12oC ทั้งสองเติบโตและสามารถทําให้ องค์ประกอบของ BCFA กลับคืนมาโดยเติม short branched chain carboxylic acid ซึ่ งเป็ นสารต้น ตอของ BCFAs ในอาหารเพาะเลี้ยง สี ทองของ S. aureus โคโลนี เนื่ องจาก isoprenoid lipid ซึ่ งเป็ น carotenoid ที่ชื่อว่าคือ staphyloxanthin (Marshall and Wilmoth, 1981) staphyloxanthin และ intermediary products แยก ออกจาก S. aureus คือ triterpenoids ที่มีสาย Carbon 30 แทนที่จะเป็ น C40 ของ Carotenoid ปกติ Staphyloxanthin คือ α-D-glucopyranosyl 1-0-(4,4-diaponeurosporen-4-oate) 6-0-(12methyltetradecanoate) ซึ่ง glucose esterified ด้วย triterpenoid carotenoid carboxylic acid และ C15 fatty acid (Marshall and Wilmoth, 1981: Pelz et al., 2005) Gene ที่ทาํ การสังเคราะห์ staphyloxanthin จัดเรี ยงอยูใ่ น crt operon (crtOPQMN) ซึ่งมี SigB-dependent promoter อยู่ upstream ของ crtO สายพันธุ์ SigB-deficient S. aureus (RN6390) ไม่ทนทานต่อตัวทําละลาย ขณะที่สายพันธุ์สายเดียวกัน lineage ที่ได้แก้ไขการขาด SigB SH1000 มี ความทนต่อ toluene (Nielsen et al., 2005) สายพันธุ์ SH1000 แสดงลักษณะ สี ทองของ S. aureus ขณะที่สายพันธุ์ SigB-deficient ขาดสารสี น้ ี Staphyloxanthin มีบทบาทสําคัญในการที่ S. aureus แก้ปัญหา oxidative stress Staphyloxanthin บริ สุทธิ์ ถูก oxidized โดยทําปฏิกิริยากับ ออกซิ เจนของหมู่ Hydroxyl (OH-) และ (ONOO-) (Clauditz et al., 2006) สายพันธุ์กลายถูกฆ่าอย่างรวดเร็ วโดย neutrophils การที่ Staphyloxanthin ส่ งผลในการป้ องกันเนื่ องจาก scarvenging ของ free radicals โดย conjugated double bonds ของ carotenoid Liu et al. (2005) ได้รายงานผลที่คล้ายกันนี้ใน สายพันธุ์กลาย crtM
8
ของ atopic dermatitis strain ของ S. aureus สายพันธุ์กลาย crtM เป็ นเชื้ อก่อโรคที่รุนแรงน้อยใน subcutaneous abscess model crtM เป็ นรหัสสําหรับ dehydrosqualene synthase Liu et al. (2008) ได้รายงานถึงการคัดกรองหา inhibitor สําหรับ human squalene synthase ต่อ S. aureus CrtM enzyme human squalene synthase inhibitor ที่ได้ทดสอบสําหรับกิจกรรมการ ลด Cholesterol ในมนุษย์ได้ขดั ขวางชีวสังเคราะห์ staphyloxanthin ในความเข้มข้นที่ต่าํ มาก ประมาณ 100 nM ส่ งผลให้เซลล์ขาด สารสี น้ ีทาํ ให้มีความไวมากขึ้นในการถูกฆ่าโดยเม็ดเลือดแดง และใน mouse infection model นี้สามารถถูกใช้เป็ นพื้นฐานสําหรับการบําบัดรักษาการติดเชื้อ Staphylococcus แนวใหม่ โดยมีเป้ าไปที่ปัจจัยความรุ นแรง virulence factor target-based ผลของ polar carotenoids ต่อ membrane fluidity โดยทําให้เมมเบรนแข็ง rigidity เพิ่มขึ้น (Gabrielska and Gruszecki, 1996; Rottem and Markowitz,1979; Sabczynski et al., 1992) ถ้าเป็ น non-polar carotenoids ทําให้ membrane เพิ่ม fluidity polar carotenoids สามารถ คลี่ span ผ่าน membrane เพิ่มความแข็ง rigidity แต่ตรงข้ามใน Sphingobacterium antarcticus สังเคราะห์ polar carotenoids (zeaxanthin) ซึ่ งคาดว่าทําให้ membrane แข็ง rigidity เมื่อเติบโตที่ 5oC เปรี ยบเทียบกับ 25oC (Jagannadhem et al., 2000) แต่อย่างไรก็ตามปริ มาณของ fluidity-promoting BCFAs unsaturated fatty acids เพิ่มขึ้น อาจเป็ นไปได้วา่ ความสมดุลขององค์ประกอบ fluidity-influencing lipids components เป็ นที่ตอ้ งการต่อการทําให้ membrane fluidity เหมาะสมที่สุดที่อุณหภูมิต่างๆ คาดหวังว่า S. aureus สายพันธุ์ที่สร้าง staphyloxanthin มี fluid membranes มีความไวต่อ membrane antimicrobial เพิ่มขึ้น มีขอ้ มูลยังไม่มากนักถึงผลของ staphyloxanthin ต่อความไวต่อ สารต้านจุลชีพของ S. aureus Chamberlain et al. (1991) ได้รายงานถึงสายพันธุ์ที่ขาด carotenoids และสายพันธุ์ที่เติบโตในอาหารที่ suppress carotenoids สายพันธุ์เหล่านี้มีความไวต่อ oleic acids ซึ่ งเป็ นสารต้านจุลชีพที่ทาํ งานแข็งขันที่เมมเบรน (membrane-active antimicrobials) Spontaneous revertants carotenoids-deficient mutant สายพันธุ์กลายผันกลับของ carotenoids-deficient mutant ต้านทานต่อ oleic acid เท่าๆ กับ สายพันธุ์แท้ ค่า polarization เฉลี่ย โดยใช้ DPH เป็ น probe แสดง ว่า สายพันธุ์สร้างสารสี มีดชั นี polarization สู งกว่าแสดงว่า membrane มี fluid น้อย ดัชนี polarization สําหรับสายพันธุ์ที่ไม่สร้างสารสี ตอบสนองต่ออุณหภูมิมากกว่า สายพันธุ์ที่สร้างสารสี ดังนั้นในกรณี น้ ี การเพิ่ม membrane fluidity สัมพันธ์กบั การเพิ่มความไวต่อ สารต้านจุลชีพที่ เมมเบรน (membrane antimicrobial) ซึ่ งตรงข้ามกับความทนต่อตัวทําละลายและความทนต่อ antimicrobial peptide Katzif et al. (2003) ได้รายงานว่าการกลายใน cold shock gene cspA ส่ งผล ให้ S. aureus ลดความไวต่อ เพปไทด์ตา้ นจุลชีพ (membrane-active human antimicrobial peptide ดัดแปลงจาก cathepsin G CspA จําเป็ นต่อการสร้าง carotenoids ในปริ มาณมากใน S. aureus ดังนั้นสายพันธุ์กลาย cspA ต้านทานต่อ cathepsin G-derived peptide สร้าง carotenoid น้อยและอาจ
9
มี fluid membrane ที่มากกว่า เนื่องจากขาด carotenoid มีความสัมพันธ์ระหว่างการเพิ่ม membrane fluidity กับการลดความไวต่อ membrane susceptibility สายพันธุ์กลายที่ตา้ น Pine-oil cleaner-resistant mutant สารละลายทําความสะอาด และสาร ฆ่าเชื้อ (cleaning and disinfecting solution) ที่ประกอบด้วนนํ้ามันสน ได้ใช้ในการคัดเลือก E. coli สายพันธุ์กลายที่ลดความไวต่อสารปฏิชีวนะหลายตัว (Moken et al., 1997) มีความกลัวว่าการใช้ สารเหล่านี้ต่อเนื่องกันจะเป็ นการส่ งเสริ มให้เกิดแบคทีเรี ยที่ตา้ นสารปฏิชีวนะ การคัดเลือกสายพันธุ์ กลายที่ตา้ นทานสารทําความสะอาด pine oil (POCr) ได้ถูกคัดเลือกโดยเพลตบนอาหารเพาะเลี้ยงที่มี สารทําความสะอาด pine oil (Price et al., 2002) สายพันธุ์กลายนี้แสดงให้เห็นถึงความไวที่ลดลงต่อ oxacillin และ vancomycin สายพันธุ์กลายทั้งหมดแสดงให้เห็นถึงการลด carotenoids ที่เป็ น องค์ประกอบลง สายพันธุ์กลาย PS12 ลด carotenoids ที่เป็ นองค์ประกอบลงอย่างมาก (Davis et al., 2004) นําสายพันธุ์กลาย PS12 ไปดําเนินการเปรี ยบเทียบหาลําดับเบสของ genome (genomic sequencing) transcriptional profiles และทําการวิเคราะห์ทางสรี ระ เปรี ยบเทียบกับสายพันธุ์พอ่ แม่ ที่เป็ น isogenic parental strain (Lamichhane-Khadka et al., 2008) gene ที่เป็ นรหัสสําหรับ dehydrosqualene desaturase (crtN) ถูก downregulated gene มากที่สุด ในสายพันธุ์ PS12 เปรี ยบเทียบกับ สายพันธุ์พอ่ แม่ COL ส่ วนในสายพันธุ์ PS12 mvaS (hydroxymethylglutaryl-CoA synthetase) acetyl CoA acetyltransferase (SACOL0426) ที่เป็ นศูนย์กลางของ mevalonate pathway ของชีวะสังเคราะห์ isoprenoids และ bacA undecaprenol kinase ทั้งหมดถูก upregulated เมื่อทํา การ inactivated การสร้าง carotenoid อย่างสิ้ นเชิงใน สายพันธุ์กลาย crtM นําไปสู่ การเพิ่มความไว ต่อ สารทําความสะอาด pine oil ดังนั้นการลดการสังเคราะห์ carotenoids สัมพันธ์กบั การลดความ ไวต่อสารทําความสะอาด pine oil การกําจัดการสังเคราะห์ carotenoids ทั้งหมดไม่สามารถ compatible กับการลดความไว เป็ นไปได้วา่ สารทําความสะอาด pine oil เหนี่ยวนําให้เกิดการ ตอบสนองต่อ oxidative stress ซึ่ง crt mutant มีความไวเพิ่มขึ้นเนื่ องจากขาด carotenoid ทั้งหมดซึ่ ง คาดว่าcrt mutant เพิ่ม membrane fluidity องค์ประกอบของ membrane lipid ที่สาํ คัญของ S. aureus คือ carotenoids staphyloxanthin มีความสําคัญต่อความทนต่อ reactive oxygen species และสาย พันธุ์กลายที่ขาดการสร้าง carotenoids แสดงให้เห็นถึงการลดความรุ นแรง (Virurence) ลง 2.3 วิธีการประเมินความไวของแบคทีเรี ยต่ อสารต้ านจุลชี พ (Antimicrobial susceptibile evaluation) การประเมินรู ปแบบความไวของเชื้ อต่อสารต้านจุลชีพเป็ นวิธีการหนึ่งในการตรวจสอบ ฟี โนไทป์ ของสายพันธุ์ของเชื้ อแบคทีเรี ยที่มีการระบาด เชื้อแต่ละสายพันธุ์มีรูปแบบความไว (susceptible) และการดื้อ (resistant) ต่อสารต้านจุลชีพแตกต่างกัน การทดสอบความเข้มข้นน้อย ที่สุดที่สามารถยับยั้งเชื้อได้ (Minimal Inhibitory Concentration = MIC) เป็ นการทดสอบความไว ที่ 10
ต้องการทราบว่าเชื้อที่ทดสอบต้องการใช้สารต้านจุลชีพแต่ละชนิดน้อยที่สุดปริ มาณเท่าใดจึงจะ หยุดการเจริ ญของเชื้อแต่ละชนิดได้ การประเมินความไวของต่อสารต้านจุลชีพทําได้โดยการ วินิจฉัย ค่า MIC วัดการเติบโตบน gradient plates และ ทําการวินิจฉัย Population analysis profiles (1) MICs การหาค่า MIC ทําได้โดย microdilution broth method โดยใช้ microdilution trays ตามมาตราฐานของ National Committee for Clinical Standards (NCCLS 2003) ใช้อาหาร BHI แทน Muller-Hinton Medium mเสนอแนะโดย NCCLS (Singh et al.,2008) เพาะบ่ม Microtiter plates ที่ 37oC (2) Gradient plates การวัดการเติบโตบน Gradient plates ใช้วนิ ิจฉัยความไวต่อสาร ต่างๆ อีกวิธีหนึ่ง ระยะทางที่สายพันธุ์เติบโตบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อเป็ นการวัดความไวหรื อการขาด ความไวต่อสารนั้น วิธี Gradient plates สามารถตรวจสอบได้ถึงความไวต่อสารที่แตกต่างเพียง เล็กน้อยกว่าค่า MIC Gradient plates เตรี ยมโดยใช้ plates สี่ เหลี่ยมขนาด 90 X 90 มม. เทอาหาร BHI agar 40 ml ลงใน plates แล้วทําให้เพลตยกขึ้นโดยวางพาดด้านหนึ่งบน pipette แก้วขนาด 1 ml (6 mm) ปล่อยให้วนุ ้ แข็งตัว 1 คืน วันรุ่ งขึ้น เทอาหาร BHI agar 40 ml ที่มีความเข้มข้นของสารต้าน จุลชีพที่เหมาะสมลงในเพลตที่มีช้ นั วุน้ ผิวเอียงที่เทไว้ก่อนนี้และตั้งให้อยูใ่ นแนวระนาบ ปล่อยให้ วุน้ แข็งตัว ปล่อยให้เพลตที่มี gradient อย่างต่อเนื่องแห้งที่ 37oC เป็ นเวลา 2 ชัว่ โมง ก่อนเพาะเชื้ อ ทําการลากเชื้อที่เพาะเลี้ยงข้ามคืนที่มีค่า OD625 = 0.1 โดยใช้ไม้พนั สําลีที่ฆ่าเชื้อแล้วจุ่มและ swab โดยขีดลาก 3 ครั้ง ให้เป็ นแนวเส้นเดียวบน Gradient plates ที่เตรี ยมใหม่ๆ เพาะบ่ม plates ในช่วง เวลาที่เหมาะสม และคาดคะเนความไวต่อสารต้านจุลชีพโดยวัดระยะที่แบคทีเรี ยหยุดเติบโต (3) Population analysis profiles การวิเคราะห์ Population analysis profiles ของ ประชากรเป็ นการวัดความไวต่อสารต้านจุลชีพอีกวิธีหนึ่ง สามารถใช้ประเมินระดับความต้านทาน ของประชากรแต่ละตัว
และช่วยให้เห็นถึงความแตกต่างของความไวแม้เพียงเล็กน้อย
ความ
ต้านทานต่อสารต่างๆ (Heteroresistance) เป็ น ลักษณะของ สายพันธุ์ MRSA และ VISA ที่สามารถ ตรวจพบได้โดยการวินิจฉัย Population analysis profiles (Pfeltz et al., 2001) ทําการวิเคราะห์หา Population analysis โดยใช้อาหาร BHI โดยใช้ microdilution broth method (Pfeltz et al., 2001) ทํา การเจือจางเป็ นลําดับของแบคทีเรี ยที่เพาะเลี้ยงข้ามคืน และ plate ลงบนอาหาร BHI agar ที่มีความ เข้มข้นของสารต้านจุลชีพช่วงที่ศึกษา หลังจากการเพาะบ่ม plates ในช่วงเวลาที่เหมาะสม นับ โคโลนีที่เกิดขึ้นใน plates เขียนกราฟ Efficiency of plating EOP ถ้า cell ในประชากรแสดงความ ไวต่อสารต้านจุลชีพเหมือนกัน เปอร์ เซนต์ของประชากรที่สร้างโคโลนีจะยังคงสู งจนกระทัง่ ตกลง 11
อย่างรวดเร็ วที่ความเข้มข้นวิกฤติโดยหลักการแล้วใกล้เคียงกับค่า MIC (Pfeltz et al., 2001) ถ้า ประชากรเป็ น Hetrogeneous EOP ลดลง กระจายกว้างไปตามช่วงของความเข้มข้น 2.4 งานวิจัยทีเ่ กี่ยวข้ อง พัชริ นทร์ วัชริ นทร์ ยานนท์ (2551) ได้ทาํ การศึกษาเชื้อแบคทีเรี ยที่เป็ นสาเหตุและความไว ต่อยาปฏิชีวนะของหู ช้ นั กลางอักเสบเฉี ยบพลันในผูป้ ่ วยเด็กอายุ 3 เดือน ถึง 5 ปี ผลการศึกษาพบว่า แบคทีเรี ยจากสิ่ งส่ งตรวจในผูป้ ่ วย 40 ราย พบร้อยละ 57.5 เป็ นแบคทีเรี ยชนิ ดเดียว ร้อยละ 42.5 เป็ น แบคทีเรี ยหลายชนิด และพบว่าร้อยละ 30.6 เป็ นเชื้ อ Haemophilus influenzae ร้อยละ 22.6 เป็ น Staphylococcus aureus, ร้อยละ 14.5 เป็ น Staphylococcus coagulase negative และร้อยละ 8.1 สําหรับเป็ น Streptococcus pneumoniae เมื่อทดสอบความไวของเชื้อแบคทีเรี ยต่อยาปฏิชีวนะ พบว่า Haemophilus influenzae ไวต่อ ampicillin ร้อยละ 73.7 และ co-trimoxazole ร้อยละ 47.4 เชื้อ Staphylococcus aureus มีความไวต่อยาปฏิชีวนะค่อนข้างดี เชื้อ Staphylococcus coagulase negative มีความไวต่อ oxacillin, clindamycin ร้อยละ75 และไวต่อ co-trimoxazole ร้อยละ 50 สําหรับเชื้อ Streptococcus pneumoniae นั้นไวต่อ penicillin, cotrimoxazole และ erythromycin เพียงร้อยละ 20 แต่ยงั ไม่ด้ือต่อ ofloxacin และ vancomycin ไพรัตน์ ศรแผลง และ วิชยั ลีลาวัชรมาศ (2010) ได้ศึกษาความไวต่อยาต้านจุลชีพของเชื้อ แลคโตบาซิ ลไลโปรไบโอติกที่แยกได้จากมูลไก่ แยก Lactobacillus ได้ท้ งั 65 ไอโซเลต ได้นาํ มา ตรวจหาความสามารถในการทนกรด ทนเกลือนํ้าดีและความไวต่อยาต้านจุลชีพ 11 ชนิด โดยการ ทดสอบความไวต่อยาต้านจุลชีพใช้วธิ ี disk diffusion ว่ามีเชื้อแลกโตบาซิ ลลัส 11 ไอโซเลต ที่ทน ต่อกรดและเกลือนํ้าดี ส่ วนรู ปแบบความไวต่อยาต้านจุลชี พทั้ง 11 ชนิด พบว่าเชื้อแลกโตบาซิ ลลัส ทั้ง 11 ไอโซเลต มี 6 ไอโซเลตที่มีความไวมากต่อยาต้านจุลชีพ penicillin, tetracycline และ chloramphenicol และมีความไวปานกลางต่อสารต้านจุลชีพ bacitracin, erythromycin และ nitrofurantoin และพบ 4 ไอโซเลต ดื้อต่อสารต้านจุลชีพ tetracycline และ 1 ไอโซเลตดื้อต่อสาร ต้านจุลชีพ bacitracin เชื้อแลกโตบาซิ ลลัสทั้ง 11 ไอโซเลทนี้ ดื้อต่อสารตามธรรมชาติ (intrinsic resistance) และต่อสารต้านจุลชีพ vancomycin, nalidixic acid และยากลุ่ม aminoglycoside เมื่อ อาศัยคุณสมบัติการทนกรด การทนเกลือนํ้าดีและการไม่ตา้ นต่อสารต้านจุลชีพ Woods และ Yam (1988) ได้ทาํ การศึกษาผลของ Oxacillin ในการใช้เป็ น สารฆ่าแบคทีเรี ย (Bactericidal) ต่อการต้าน β-Lactamase Hyperproducing S. aureus ผลการศึกษาพบว่า Oxacillin มี ความสามารถเป็ น Bactericidal และจากการศึกษาในสิ่ งมีชีวติ (in vivo) Oxacillin มีประสิ ทธิ ภาพ ในการต้าน β-Lactamase Hyperproducing S. aureus
12
Mishra, N.N. et.al., (2010) ได้ทาํ การศึกษา Carotenoid-related alteration of cell membrane fluidity ส่ งผลกระทบต่อความไวของ S. aureus ต่อ Host defense peptides daptamycin โดยศึกษาในสายพันธุ์พอ่ แม่ที่มี carotenoid biosynthesis operon (crtOPQMN) สมบูรณ์ สายพันธุ์ กลายที่ขาด crtM และสายพันธุ์ crtMN multicopy plasmid-complemented variant ผลแสดงว่า crtMN-complemented strain เพิ่มการผลิต carotenoids เพิ่ม CM rigidity และความไวต่อการถูกฆ่า โดย cationic peptides ซึ่ งข้อมูลนี้สนับสนุนความคิดรวบยอดที่วา่ ชีวะสังเคราะห์ carotenoids ทําให้ S. aureus มีความสามารถในการทําลาย non-oxidative host defenses ที่ mediated โดย cationic peptides โดยมีศกั ยภาพในการเพิ่ม membrane rigidity Tunyapanit W. et al., (2014) ได้ทาํ การศึกษาความไวต่อสารต้านจุลชีพของ Acinetobacter baumannii ที่คดั แยกจากคนไข้ในโรงพยาบาล สารต้านจุลชีพที่ใช้ศึกษาคือ cefoperazone/sulbactam colistin imipenem และ rifampicin ใช้วธิ ี E-test ในการวินิจฉัยความไวต่อ สารต้านจุลชีพ และหาค่า minimal inhibitory concentration (MIC) A. baumannii มีความไวต่อ colistin 97% cefoperazone/sulbactam 69% imipenem 45% และ rifampicin 13% 59% เป็ น multidrug–resistant A. baumannii (MDR A. baumannii) colistin ดีกว่า cefoperazone/sulbactam imipenem และ rifampicin ในการต้าน MDR A. baumannii MIC50 MIC90 ของ colistin คือ 0.75 และ 1µg/ml ตามลําดับ Non-MDR A. baumannii ไวต่อ cefoperazone/sulbactam 100% colistin 95%imipenem 93% และ rifampicin 2% ในบรรดาสารปฏิชีวนะที่ทดสอบ colistin สามารถต้าน MDR A. baumannii และ Non-MDR ได้ดีที่สุด cefoperazone/sulbactam และ imipenem แสดงให้ เห็นถึงกิจกรรมการต้าน non-MDR isolates ได้ดี และ การใช้ cefoperazone/sulbactam ร่ วมกับ rifampicin อาจมีประโยชน์ในการใช้รักษาการติดเชื้ อที่เกิดจาก MDR isolates
13
